Kit per DNA ligasi T4 Molecular Cloning

Model No.
G3340-100
Contenuto
Standard
Uso
Reagenti di laboratorio, Analitica Reagenti, Insegnamento Reagenti
Habit Denominazione
Reattivo Speciale
Applicazione
Industria, Ricerca scientifica
Proprietà
Reattivo biochimica
conservazione
-20ºc
periodo di validità
12 mesi
mod
1 set
parole chiave
DNA Ligase
Pacchetto di Trasporto
Carton
Specifiche
500U
Marchio
Servicebio
Origine
China
Prezzo di riferimento
$ 20.70 - 31.50
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Descrizione del Prodotto

Introduzione:
La T4 DNA ligasi può catalizzare il legame di DNA o RNA a doppio filamento appiccicoso o ad estremità smussate tra l'estremità 5'-P e l'estremità 3'-OH con un legame fosfodiestere. Allo stesso tempo, l'enzima può anche riparare i nick a filamento singolo in catene ibride a doppio filamento di DNA, RNA e DNA/RNA.
Definizione di attività: Un'unità di enzima può catalizzare 1 nmol di pirofosfato marcato con 32P in ATP attraverso la reazione di spostamento entro 20 minuti a 37°C (un'unità è pari a circa 200 unità di attacco dell'estremità adesiva).

  Tampone di conservazione per DNA ligasi T4: 20 mm Tris-HCl (pH 7.5), 50 mm KCl, 1 mm DTT, 50% (v/v) glicerolo.
5×di tampone di DNA ligasi T4: 250 mm Tris-HCl (pH 7.6), 50 mm MgCl2 , 5 mm ATP, 5 mm DTT, Enhancer.

Conservazione e trasporto
Trasporto con  ghiaccio umido; conservazione a -20°C, valida per 12 mesi.
Numero componente Componente G3340-50 G3340-100
G3340-1 T4 DNA ligasi 250 U (50 μL) 500 U (100 μL)
G3340-2 5×di tampone T4 DNA ligasi 1 ml 2×1 ml
Manuale dell'utente 1
Condizioni di reazione di ligazione

La reazione di ligazione a 25°C per le estremità appiccicose richiede 5-30 minuti; la reazione di ligazione a 25°C per le estremità piatte non supera 2 ore o la reazione a 4°C per una notte.

Conversione dei prodotti di ligazione

1. Estrarre cellule competenti (quali E.coli DH5α, E.coli Top10, ecc.) dal frigorifero 80ºC e porle su ghiaccio per scongelare;

Aggiungere il campione reagito allo stato competente, spostare delicatamente il fondo della provetta con le dita per miscelare e bagnare in ghiaccio per 30 minuti;

3. Quindi, porre il prodotto in un bagno d'acqua di 42ºC per scaldare gli urti per 90 s. Dopo averlo finito, metterlo rapidamente su ghiaccio per 2-5 min in un bagno di ghiaccio;

4. Prelevare 900 μL di terreno SOC o LB sterile e aggiungerlo alla provetta EP. Dopo la miscelazione, collocare la provetta EP su un agitatore e incubare a 220 rpm a 37°C per 1 ora per risanimare i batteri (può essere anche collocata in un incubatore a 37°C. Porre la coltura per 1 ora);

5. A seconda delle esigenze sperimentali, prelevare volumi diversi di cellule competenti trasformate e aggiungerli al terreno solido LB contenente i corrispondenti antibiotici, distribuire le cellule in modo uniforme e, dopo che il liquido è stato completamente assorbito, capovolgere la piastra nell'incubatore a 37°C e coltivare per una notte.


Identificazione di cloni positivi

Le colonie monoclonali cresciute sulla piastra vengono prelevate per l'identificazione PCR di colonie, o dopo la coltura, il plasmide viene estratto mediante digestione con restrizione o identificazione PCR, oppure il plasmide estratto viene direttamente sequenziato e analizzato per l'identificazione.

Precauzioni

1. Si consiglia di configurare il sistema di reazione su ghiaccio.

2. Quando la concentrazione del vettore e del frammento bersaglio è bassa, non è necessario aggiungere acqua e utilizzarla direttamente per il suo approvvigionamento.

Si raccomanda che il rapporto molare tra il DNA vettoriale e il frammento di DNA inserito sia 1:3~1:10.

Una piccola quantità di precipitazione nel tampone di DNA ligasi T4 da 5×è normale. Può essere disciolto a 37°C prima dell'esperimento e sarà usato dopo miscelazione completa. Non ha alcun effetto sull'esperimento; si consiglia di scioglierlo in aliquote e congelare per l'uso.

Si raccomanda di estrarre T4 DNA ligasi quando usato e di rimettersi a -20ºC immediatamente dopo l'uso.

Quando l'elettroporazione viene usata per la trasformazione, il prodotto di ligazione deve essere purificato mediante metodo a colonna o metodo di precipitazione con etanolo.

Quando si collega il vettore ad estremità smussate al frammento di DNA, il vettore deve essere defosforilato (G3400 è raccomandato) per impedirne l'autocircolazione.

8. Indossare camice da laboratorio e guanti monouso durante il funzionamento.
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Agenti Chimici

TERAPIASINFRONTERAS.COM, 2023