Competitivo enzima imunoensaio Kit para
Análise quantitativa de Cloxacilina
1. Justificativa
Cloxacilina é um antibiótico, que é amplamente aplicado em animais de tratamento da doença. Porque tem a tolerância e a reação anafilática, seus resíduos em alimentos de origem animal alimentos são nocivos para o homem; é rigorosamente controlado em uso na UE, os EUA e a China. Actualmente, ELISA é a abordagem comum na supervisão e controlo de aminoglicosídeo drug
Este kit é um novo produto de detecção residual baseada na tecnologia de ELISA, que custa apenas 90 min em cada operação e pode reduzir consideravelmente os erros de funcionamento e intensidade de trabalho.
2. Princípio de teste
Este kit é baseado em acções indirectas-ELISA competitiva tecnologia. Os poços de microtitulação são revestidos com antígeno de acoplamento. cloxacilina resíduo em amostra concorre com o antígeno revestidos na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição da vacina conjugada enzima, TMB substrato é usado para mostrar a cor. Absorvência da amostra é negativamente relacionado a cloxacilina nele residir, depois de comparar com a curva padrão, multiplicado pela diluição vários, cloxacilina quantidade de resíduos na amostra pode ser calculado.
3. Os pedidos
Este kit pode ser usado na análise qualitativa e quantitativa dos resíduos de cloxacilina em tecidos animais (músculo e fígado),leite e mel.
4. Reações cruzadas
Cloxacilina...........................…100%
Dicloxacilina...............…........…......12,5%
Oxacilina...................................0,5%
Penbritin..........................… .....<0,1%
Penicilin G............................…<0,1%
Amoxicilina ................…<0,1%
5. Materiais Necessários
5.1 Equipamentos:
----Placa de microtitulação espectrofotómetro (450nm/630nm)
----Evaporador rotativo ou gás nitrogênio sistema de secagem
----Homogeneizador
----Shaker
----Vórtex
----Centrifugar
----Balança analítica (A indutância: 0,01g)
----Uma pipeta graduada: 10ml
----Borracha lâmpada de pipetas
----Balão volumétrico: 100ml, 1L
----Proveta de vidro: 10ml
----Poliestireno tubo de centrifugação: 2ml, 50ml
----Micropipetas: 20 μl-200μl, 100ΜL-1000μl
250ΜL-multipipette
5.2 Reagentes
---- Acetonitrilo (AR)
---- Acetato de etilo (AR)
----Dissódico fosfato de hidrogénio dodecahydate
(Na2HPO4.12H2O AR)
----Sódio fosfato monopotássico dihidratado (NaH2PO4 2H2O, AR)
----Água desionizada
6. Componentes do Kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidas com antigen
Apramicina soluções padrão(6×1ml/garrafa)
0ppb, 0.2Ppb, 0.6Ppb,1.8Ppb, 5.4Ppb, 16.2ppb
Enriquecidas solução padrão: 1ml, 100ppb
Solução de anticorpos (7ml).................…tampa verde
O conjugado enzimático (12ml) ............…tampa vermelha
Solução de substrato A (7ml)............tampa branca
Solução de substrato B (7ml)............…tampa vermelha
Solução de Paragem (7ml)...............…tampa amarela
20×concentrado solução de lavagem (40ml)
............…..........….Tampa transparente
2×concentrados de solução de extracção (50ml)
...........................…..Tampa azul
7. Preparação de reagentes
Solução 1: acetonitrilo e acetato de etilo mistura
Peso 20ml de ácido acetonitrilo, adicionar 10ml de acetato de etilo,misturar completamente.
Solução 2: solução de extracção
Diluir a 2×concentrados de solução de extracção com água deionizada em relação volume de 1:1, que será utilizado para extração de amostra, esta solução pode ser armazenado a 4ºC durante 1 mês.
Solução 3 solução de lavagem
Diluir a 20×concentrado solução de lavagem com água deionizada em relação volume de 1:19, que será usado para lavar as placas. Esta solução pode ser armazenado a 4ºC durante 1 mês.
8. Preparação da amostra
8.1 Aviso e precauções antes da operação:
(A) use um sugestões no processo de experimento e alterar as dicas para absorver o reagente diferente.
(B) Se certificar de que todos os instrumentos experimentais são limpos, caso contrário ela afetará o resultado do ensaio.
(C) Manter os tecidos de origem animal na amostra congelar.
(D) Por favor, incline o tubo de centrífuga quando tendo a camada sobrenadante após centrifugar.
(E) amostra preparada pode ser armazenado por 12h a 4oC.
8.2 Mel
----Pesar 2,0±0,05g homogeneizado amostra num 50ml poliestireno do tubo de centrífuga, adicionar 2 ml de água demonizadas, dissolver completamente, em seguida, adicionar 8 ml de solução 1, e o vértice completamente durante 3 min;
----Centrifugar a temperatura ambiente durante 5 min, pelo menos 3000g;
----Tomar o supernate 1ml de 10ml de vidro transparente, tubo de secagem com 50-60° C o azoto e o banho de água.
------Adicionar 1 ml solução2,vértice 2min ,misturar completamente.
----Tomar 50 μl da solução preparada para o ensaio.
8.4 Leite
----Pesam 100ΜL leite fresco para 2ml tubos de poliestireno, adicionar 900ΜL solução 3,vértice 2min,misturar completamente.
----Tomar 50 μl da solução preparada para o ensaio.
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes do ensaio:
9.1.1 Verifique se todos os reagentes e micropoços são todos em temperatura ambiente (20-25ºC).
9.1.2 Devolver todos os reagentes de repouso para 2-8ºC imediatamente depois de utilizado.
9.1.3 Lavar o micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o factor vital para a reprodutibilidade da análise de ELISA.
9.1.4 Evitar a luz e a cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 Doseamento etapas:
9.2.1 Tomar todos os reagentes para fora em temperatura ambiente (20-25ºC) por mais de 30min, agitar antes de usar.
9.2.2 Obter o micropoços necessários e devolva o resto no zip-lock bag em 2-8ºC imediatamente.
9.2.3 Número: Número de cada posição microwell e todas as normas e as amostras devem ser executados em duplicado. Registre as normas e as posições de amostras.
9.2.4 Adicionar standard /amostra: adicionar 50 ul da solução padrão ou amostra preparada para poços correspondente. Adicionar 50 μl de solução de anticorpos. Misturar cuidadosamente, sacudindo a placa manualmente e incubar durante 30min a 25oC com tampa.
9.2.5 Lavar: Remova a tampa com cuidado e pureza do líquido de poços e enxagúe o micropoços com 250ΜL diluído a solução de lavagem (solução 3) no intervalo de 10s por 4 a 5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente (resto bolhas de ar podem ser eliminados com a ponta não utilizados).
9.2.6 Adicionar conjugada enzima: adicione 100 μl de conjugado enzimático para cada bem. Misturar cuidadosamente, sacudindo a placa manualmente e incubar durante 30min a 25oC com tampa. Repita 9.2.5 Lavar .
9.2.7 Coloração: Adicionar 50 μl de solução A e 50 μl de solução B para cada bem. Misturar cuidadosamente, sacudindo a placa manualmente e incubar durante 15 min a 25oC com tampa
9.2.8 Medir: adicionar 50 ul da solução de paragem para cada bem. Misturar cuidadosamente, sacudindo a placa manualmente e medir a absorvância a 450 nm (recomenda medir com o duplo-onda de 450/630nm. Leia o resultado dentro de 5 min após a adição da solução de paragem).
10. Resultados
10.1 absorvância percentuais
Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorção do primeiro standard (norma zero ) e multiplicado por 100%. O padrão de zero fica assim igual a 100% e os valores de absorvância são expressos em percentagens.
B
Absorvância (%) = -- ×100%
B0
B --absorvância (padrão ou amostra)
B0 --absorvância padrão zero
10.2 curva padrão
----Para desenhar uma curva padrão: ter valor de absorção das normas como eixo y, semi logaritmo da concentração da apramicina solução padrões (ppb) como eixo x.
----A apramicina concentração de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração, é multiplicada pela diluição correspondente múltiplo de cada amostra seguido, e a concentração real da amostra.
Por favor note:
Software Especial foi desenvolvido para todas as análises de dados, que podem ser fornecidas a pedido.
Factor de diluição da amostra:
Mel.................................................................................4
11. Sensibilidade, exactidão e precisão
A sensibilidade do teste: 0.3PPB
Limite de detecção:
Mel......................................................................2 ppb
Precisão:
Mel ............................................................ 100±20%
Precisão:
Coeficiente de variação do kit de ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras será reduzida se os reagentes e amostras não tenham sido regulada a temperatura ambiente (20-25ºC).
12.2 não permitem micropoços secar entre as etapas para evitar tentativas de reprodutibilidade e operar o próximo passo imediatamente após bater o micropoços titular.
12.3. Agitar cada reagente com cuidado antes de utilizar
12.4. Mantenha a sua pele longe da solução de paragem para é 1M H2SO4 solução.
12.5 Não usar os kits desatualizado. Não trocar os reagentes de lotes diferentes, para ela cairá a sensibilidade.
12.6 manter os kits ELISA em 2-8ºC,não congelar. Retentor assentam as placas microwell evite a luz do sol direto para a amostra padrão e o incolor reagente cromogénicos são sensíveis à luz.
12.7 Solução de substrato deve ser abandonada se transforma de cores. Os reagentes podem ser vire ruim se o valor de absorvência (450/630nm) do padrão de zero for inferior a 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 A coloração das necessidades de reação de 15 min após a adição de uma solução e solução B. e você pode prolongar o tempo de incubação se a cor for demasiado clara a determinar. Nunca exceda 30min, pelo contrário, encurtar o tempo de incubação adequadamente.
12.9 A melhor temperatura de reação é de 25ºC. Maior ou menor temperatura provocará alterações de sensibilidade e os valores de absorvência.
13. Para bagagem
Condições de armazenamento: 2-8oC.
Período de armazenamento: 12meses.