Kit de imunoensaio enzimático competitiva para
Análise quantitativa de estreptomicina
1. Justificativa
A estreptomicina é um aminoglicosídeo antibiótico, que é amplamente aplicado no tratamento de doenças animais. Para que tenha a neurotoxicidade e toxicidade renal, seus resíduos em alimentos de origem animal é nocivo para o homem; é rigorosamente controlado em uso na UE, os EUA e a China. Actualmente, ELISA é a abordagem comum na supervisão e controlo de estreptomicina drug
Este kit é um novo produto para a detecção de resíduos de medicamentos baseados na tecnologia de ELISA, que custa apenas 45min em cada operação e pode reduzir consideravelmente os erros de funcionamento e intensidade de trabalho.
2. Princípio de teste
Este kit é baseado na prova ELISA competitiva direta. Os poços de microtitulação são revestidas com anticorpos de acoplamento. A estreptomicina resíduo em amostra concorre com a enzima revestidos do marcador na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição da enzima , substrato chromegenic conjugada é usado para mostrar a cor. Absorvência da amostra é negativamente relacionado à estreptomicina resíduo em ti, depois de comparar com a curva padrão, multiplicado pelo factor de diluição, estreptomicina quantidade de resíduos na amostra pode ser calculado.
3. Os pedidos
Este kit pode ser usado na análise quantitativa e qualitativa de estreptomicina resíduo em tecido (carne de porco, carne de frango, o fígado), peixe e camarão, leite (leite cru, o leite UHT e leite reconstituído a partir de leite pasteurizado, leite bebidas), soro de leite em pó desnatado (leite gordo em pó, leite desnatado em pó), mel, geleia real...
4. Reações cruzadas
A estreptomicina..........................100,0%
Diidrostreptomicina...............……… 106%
Sulfato de estreptomicina.....................67%
Neomicina.........….....................…<1%
Gentamicina.....................… .....…<1%
Canamicina...........................…<1%
Amicacina..................…............<1%
A espectinomicina........<1%
Apramicina..............................<1%
5. Materiais Necessários
5.1 Equipamentos
----Placa de microtitulação espectrofotómetro (450nm/630nm)
----Homogeneizador
----Vórtex
----Centrifugar
----Balança analítica (A indutância: 0,01g)
----Uma pipeta graduada: 10ml
----Lâmpada de pipetas de Borracha
----Tubo de centrífuga de Poliestireno Expandido: 2ml, 50ml
----Micropipetas: 20 μl-200μl, 100ΜL-1000μl
250ΜL-multipipette
5.2 Reagentes
----Ácido tricloroacético (AR)
----Hidróxido de sódio (AR)
----Água desionizada
6. Componentes do Kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidas com antigen
Soluções padrão (6 garrafas×1ml/garrafa)
0ppb,0,05ppb,0,15ppb,0,45 ppb,1,35ppb,4,05 ppb
Solução padrão aditiva: (1ml/garrafa) 1ppm
Concentrados conjugada enzima 1ml...….Tampa vermelha
Diluente conjugada enzima 10ml....... tampa verde
Solução de substrato um 7ml..........…tampa branca
Solução de substrato B 7ml............tampa vermelha
Solução de paragem 7ml................…tampa amarela
20×concentrado 40ml de solução de lavagem
.........................Tampa transparente
2×concentrado 50ml de solução de extracção
............................…Tampa azul
7. Preparação de reagentes
Solução 1: 1% ácido tricloroacético
Dissolver 1,0g de ácido tricloroacético com 100ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 2: 1,5% de ácido tricloroacético
Dissolver 1,5 g de ácido tricloroacético com 100ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 3: 0.1Mol/L NaOH
Dissolver 0,4 g de hidróxido de sódio com 100ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 4: solução de extracção
Diluir a 2×concentrados de solução de extracção com água deionizada em relação ao volume de 1:1, que será utilizado para extração de amostra; esta solução pode ser armazenado a 4ºC durante 1 mês.
Solução 5: solução de lavagem
Diluir a 20×concentrado solução de lavagem com água deionizada em relação ao volume de 1:19, que será usado para lavar as placas. Esta solução pode ser armazenado a 4ºC durante 1 mês.
8. Preparação da amostra
8.1 Aviso e precauções antes da operação
(A) Use as dicas pontuais no processo de experimento e alterar as dicas para absorver o reagente diferente.
(B) Se certificar de que todos os instrumentos experimentais estão limpos; caso contrário irá afectar o resultado do ensaio.
(C) amostra preparada deve ser utilizado imediatamente, don não conservar mais de 4 h em temperatura ambiente.
8.2(a carne de porco, carne de frango, o fígado)
----Pesar 1,0±0,05g de tecido homogeneizadas da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, adicionar 2 ml de solução de ácido tricloroacético a 1%(Solução 1), vortex para 5min para misturar completamente.
---Centrífuga para separação: 3000g / 5min / temperatura ambiente.
---Tomar 100ml do sobrenadante, adicionar 30ml de NaOH 0.1mol/L(Solução 3), em seguida, adicionar 870 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição...................30
8.3 Produtos aquáticos
(1)O CAMARÃO
----Pesar 1,0±0,05g de camarão homogeneizadas da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, adicionar 2 ml de solução de ácido tricloroacético a 1%(Solução 1), vortex para 5min para misturar completamente.
---Centrífuga para separação: 3000g / 5min / temperatura ambiente.
---Tomar 100ml do sobrenadante, adicionar 30ml de NaOH 0.1mol/L(Solução 3), em seguida, adicionar 870 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
(2) Os peixes
----Pesar 1,0±0,05g de peixe homogeneizadas da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, adicionar 2 ml de solução de ácido tricloroacético a 1%(Solução 1), vortex para 5min para misturar completamente.
---Centrífuga para separação: 3000g / 5min / temperatura ambiente.
---Tomar 100ml do sobrenadante, adicionar 900 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição...................30
8.4 Leite (leite cru, o leite UHT e leite reconstituído a partir de leite pasteurizado, leite bebidas), soro
----Adicionar 30ml de leite ou soro de 2 ml da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno,
----Adicionar 870 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição...................30
8.5 Leite em pó desnatado
----Pesar 1,0±0,05g de leite em pó desnatado da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml e adicionar 10 ml de água desionizada. vortex durante 5 min para misturar completamente.
---Tomar 100ml do sobrenadante, adicionar 900 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição...................100
8.6Honey
----Pesar 1,0±0,05g de mel da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno de 50 ml, adicionar 4 ml de água deionizada, vortex para 5min até a dissolução completa da amostra.
---Tomar 200ml de solução de limpeza, adicionar 600 ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 30s para misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição...................20
8.5 geleia real
----Pesar 1,0±0,05g de geleia real da amostra para um tubo de centrifugação de poliestireno 50ml.
----Adicionar 3 ml de solução de ácido tricloroacético 1,5%(Solução 2), vortex para 5min, e em seguida centrifugar a temperatura ambiente (20-25ºC) 5min na 3000g;
----Tomar 100ml da camada sobrenadante(evitar o objeto flutuante), e misturar com 110ml de NaOH 0.1mol/L (solução 3), ajustar o pH de 6 a 8, em seguida, adicionar 790ml de solução de extracção(Solução 4), vortex para 1min, misturar completamente.
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Nota: Este método pode ter 2 ppb de efeito de fundo, o que não afetará a determinação da amostra de acordo com o LMR.
Factor de diluição...................30
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes de doseamento
9.1.1 Verifique se todos os reagentes e micropoços são todos em temperatura ambiente (20-25ºC).
9.1.2 Devolver todos os reagentes de repouso para 2-8ºC imediatamente depois de utilizado.
9.1.3 Lavar o micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o factor vital para a reprodutibilidade da análise de ELISA.
9.1.4 Evitar a luz e a cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 As etapas de ensaio
9.2.1 Tomar todos os reagentes para fora em temperatura ambiente (20-25ºC) por mais de 30min, agitar antes de usar.
9.2.2 Obter o micropoços necessários e devolva o resto no saco zip-lock em 2-8ºC imediatamente.
9.2.3 A solução de lavagem concentrado e de mosto de solução de extracção deve ser aquecido antes de utilizar;
9.2.4 Número: Número de cada posição microwell e todas as normas e as amostras devem ser executados em duplicado. Registre as normas e as posições de amostras.
9.2.5 Adicionar solução padrão/amostra: adicionar 50 µl da solução padrão ou amostra preparada para poços correspondente.
9.2.6 Diluir o concentrado conjugada enzima: misture a enzima concentrada e conjugada enzima conjugada no volume de diluente de 1:10(ex. 0,5Ml de concentrado conjugada enzima + 5 ml de diluente conjugada enzima ), misturar completamente, (esta mistura não pode ser conservada, utilize imediatamente).
9.2.7 Adicionar conjugada enzima diluído (9.2.6): Adicionar 50 μl da vacina conjugada enzima diluídos para cada bem, agitar a placa manualmente para misturar e incubar durante 30min a 25ºC com tampa.
9.2.8 Lavar: Remova a tampa com cuidado e despeje o líquido de poços e enxagúe o micropoços com 250 µl de solução diluída de solução de lavagem ( 5) no intervalo de 10s por 4 a 5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente (resto bolhas de ar podem ser eliminados com a ponta não utilizados).
9.2.9 Coloração: adicionar 50 µl da solução A e 50µl de solução B para cada bem. Misturar agitando suavemente a placa manualmente e incubar durante 15 min a 25ºC com tampa (ver 12.8)
9.2.10 Medir: adicionar 50 µl da solução de paragem para cada bem. Misturar agitando suavemente a placa manualmente e medir a absorvância a 450 nm (recomenda com a medida de comprimento de onda duplo de 450/630nm. Leia o resultado dentro de 5 min após a adição da solução de paragem).
10. Resultados
10.1 absorvância percentuais
Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorção do primeiro standard (norma zero) e multiplicado por 100%. O padrão de zero fica assim igual a 100% e os valores de absorvância estão apresentadas em porcentagens.
B --absorvência da amostra padrão (ou)
B0 --absorvância da norma zero
10.2 curva padrão
----Para desenhar uma curva padrão: ter valor de absorção das normas como eixo y, semi concentração logarítmica da solução de padrões de estreptomicina (ppb) como eixo x.
----A estreptomicina concentração de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração é multiplicado pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguido, e a concentração real da amostra.
Por favor note:
Software Especial foi desenvolvido para análise de todos os dados que podem ser fornecidas a pedido.
11. Sensibilidade, exactidão e precisão
A sensibilidade do teste: 0,05ppb
Limite de detecção
..................... Tecido….……… 1.5PPB
Peixes e camarões...............….……… 1.5PPB
Leite,...........................…1.5Ppb soro
Leite em pó desnatado ...................….......5 ppb de mel.....................….….......1ppb
Geleia real........…1.5PPB
Exactidão
Tecido/peixes e camarões/soro /Mel / geleia real.............................................................90±15%
Leite/leite em pó desnatado ..........................................…100±30%
Precision
Coeficiente de variação do kit de ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras será reduzida se os reagentes e amostras não tenham sido regulada a temperatura ambiente (20-25ºC).
12.2 não permitem micropoços secar entre as etapas para evitar tentativas de reprodutibilidade e operar o próximo passo imediatamente após bater o micropoços titular.
12.3. Agitar suavemente cada reagente antes de usar.
12.4. Mantenha a sua pele longe da solução de paragem para é a 0,5M H2SO4 solução.
12.5 Não use os kits desatualizado. Não trocar os reagentes de lotes diferentes, para ela cairá a sensibilidade.
12.6 manter os kits ELISA em 2-8ºC,não congelar. Retentor assentam as placas microwell evite a luz do sol direto para a amostra padrão e o incolor reagente cromogénicos são sensíveis à luz.
Solução de substrato 12,7 deve ser abandonada se transforma as cores.Os reagentes podem ser vire ruim se o valor de absorvência (450/630nm) do padrão de zero for inferior a 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 A coloração das necessidades de reação de 15 min após a adição de uma solução e solução B. e você pode prolongar o tempo de incubação para 20min se a cor for demasiado clara a determinar. Nunca exceda 25min, pelo contrário, encurtar o tempo de incubação adequadamente.
12.9 A melhor temperatura de reação é de 25ºC. Maior ou menor temperatura provocará alterações de sensibilidade e os valores de absorvência.
13. Para bagagem
Condições de armazenamento: 2-8ºC.
Período de armazenamento: 12meses.