Kit de imunoensaio enzimático competitiva para
Análise quantitativa de lincomicina
1. Justificativa
Lincomicina é um antibiótico de espectro estreito, o que pode inibir a síntese de proteínas de bacilos, no entanto, bacilos tem resistência cruzada parcial a esta droga e outros macrolídeos. Absorção de tomar o medicamento é ineficiente e canal alimentar de sintomas como naupathia, anabole, glossite rectitis, diarréia e prurido perianal pode ocorrer em 10%~20% dos pacientes que tomará; metabolismo dessa droga é principalmente no fígado e pode ser excretada pelo rim, passagem biliar e trato intestinal, 40% dela é excretado no protótipo com dejecta.
Este kit é um novo produto baseado na tecnologia de ELISA, que é rápido (apenas 45 minutos em uma operação), fácil, precisas e minúsculas em comparação com a política comum de análise instrumental, e assim ele pode reduzir consideravelmente o erro de funcionamento e intensidade de trabalho.
2. Princípio de teste
Este kit de ELISA foi projetado para detectar a lincomicina baseado no princípio do "indirecto" anticoncorrencial ELISA. Os poços de microtitulação são revestidos com capturar BSA-linked antígeno. Lincomicina na amostra concorre com o antígeno para a ligação para o número limitado de anticorpos. Após a adição da vacina conjugada enzima e substrato TMB, o sinal é medido em um fotómetro de ELISA. A absorção é inversamente proporcional à concentração de lincomicina na amostra.
3. Os pedidos
Este kit pode ser usado na análise quantitativa e qualitativa de lincomicina resíduo em mel, geleia real...
4. Reações cruzadas
Lincomicina........................100%
Clindamicina........................1,5%
Kitasamycin..................….….…<0,1%
Espiramicina .........................<0,1%
Eritromicina......................…<0,1%
A tilosina........................….…<0,1%
Tilmicosina........................…<0,1%
Apramicina.......................….…<0,1%
A tiamulina..................….….........…<0,1%
A espectinomicina..................…<0,1%
5. Materiais Necessários
5.1 Equipamentos:
----Placa de microtitulação espectrofotómetro (450nm/630nm)
----Evaporador rotativo/instrumento de secagem de azoto
----Homogeneizador
----Shaker
----Vórtex
----Centrifugar
----Balança analítica (A indutância: 0,01g)
----Uma pipeta graduada: 10ml
----Lâmpada de pipetas de Borracha
----Balão volumétrico: 500ml
----Proveta de vidro:10ml
----Tubo de centrífuga de poliestireno:2ml,10ml, 50ml
----Micropipetas:20ml-200ml, 100ml-1000ml
250ul-multipipette
5.2 reagentes:
----Metanol (AR)
-----N-hexano
-----Clorofórmio (triclorometano, AR)
----De carbonato de sódio anidro (Na2CO3, AR)
(Para o mel)
----NaHCO3 (ar, para o mel)
----Água desionizada
6. Componentes do Kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidas com antigen
Lincomicina soluções-padrão(6X1ml/garrafa)
0ppb,0.1Ppb,0.3Ppb,0.9Ppb,2.7Ppb,8.1PPB
Solução padrão aditiva:(1ml/garrafa) 1ppm
A vacina conjugada enzima 1ml...............tampa vermelha
Solução de anticorpos 7ml .............tampa verde
Solução de substrato .........7ml tampa branca
Solução de substrato B 7ml ……......…tampa vermelha
Solução de paragem 7ml................tampa amarela
20Xconcentrated 40ml de solução de lavagem
...............……… Tampa transparente
2Xconcentrated 50ml de solução de extracção
........................….… Tampa azul
7. Preparação de reagentes:
Solução 1: solução de metanol
Misturar 70 ml de metanol com 30 ml de água e misturar completamente.
Solução 2: 0,1M CB (PH=10.6)
Dissolver 4.66g de carbonato de sódio anidro, 0,5G NaHCO3 com água e perfazer 500 ml.
Solução 3: solução de extracção
Diluir o 2Xconcentrate solução de extracção com água deionizada em relação ao volume de 1:1 (ou de acordo com o requisito), que será utilizado para a extracção da amostra. A solução de extracção diluídos pode ser conservado durante 1 mês a 4ºC.
Solução 4: solução de lavagem
Diluir a solução de lavagem Xconcentrate 20 com água deionizada em relação ao volume de 1:19(ou de acordo com o requisito), que será usado para lavar a placa. A solução de lavagem diluído pode ser conservado durante 1 mês a 4ºC.
8. Preparação da amostra
8.1 Aviso e precauções antes da operação:
(A) Use as dicas pontuais no processo de experimento e alterar as dicas para absorver o reagente diferente.
(B) Garantir que todas as ferramentas experimentais estão limpos.
(C) as amostras devem ser utilizadas para o ensaio de imediato.
8.2 Mel:
8.2.1 O método A
----Pesar 1,0±0,05g de mel em um tubo de centrífuga de poliestireno de 10 ml, adicionar 1 ml de solução de metanol(Solução 1), vortex para dissolver. E depois agitar completamente para 2min com agitador
----Transferência do supernate 100ml a 2 ml, em seguida, adicionar 900 ml de solução de extracção (solução 3), vortex 30s,misturar completamente;
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
8.2.2 Método B
----Pesar 2,0±0,05g de mel em um tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml, adicionar 2 ml de 0,1M CB (solução 2), vortex para dissolver. E depois agitar completamente para 2min
------Adicionar 8 ml de clorofórmio ,vortex 2min.
----Centrifugar a 3000g durante 5 min, em temperatura ambiente.
----Remover o supernate e transferir 4 ml da subnatant para 10ml limpe o tubo de vidro, seque com 50-60oC / água fluxo de gás nitrogênio.
-----Adicionar 1 ml de N-hexano vortex por 30s, e em seguida adicionar 1 ml de solução de extracção (solução 3). vortex por 30s.
----Centrifugar a 3000g durante 5 min, em temperatura ambiente
-------Remover o sobrenadante camada orgânica e tomar 50 ml da solução da camada de substrato para o ensaio.
9.As etapas do ensaio:
9.1 Aviso antes do ensaio:
9.1.1 Verifique se todos os reagentes e micropoços são todos em temperatura ambiente (20-25ºC).
9.1.2 Devolver todos os reagentes de repouso para 2-8ºC imediatamente depois de utilizado.
9.1.3 Lavar o micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o factor vital para a reprodutibilidade da análise de ELISA.
9.1.4 Evitar a luz e a cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 Doseamento etapas:
9.2.1 Tomar todos os reagentes para fora em temperatura ambiente (20-25ºC) por mais de 30min, agitar antes de usar.
9.2.2 Obter o micropoços necessários e devolva o resto no saco zip-lock em 2-8ºC imediatamente.
9.2.3 Solução de lavagem deve ser aquecido antes de usar.
9.2.4 Número: Número de cada posição microwell e todas as normas e as amostras devem ser executados em duplicado. Registre as normas e as posições de amostras.
9.2.5 Adicionar solução padrão / amostra: adicionar 50 µl da solução padrão ou amostra preparada para poços correspondente.
9.2.6. Misture a solução de anticorpos e conjugada enzima .misturar a solução de anticorpos e conjugada enzima na proporção do volume de 10:1,misturar completamente .(Nota,esta mistura de solução pode não ser stock ,deve ser imediatamente o uso após misturar. )
9.2.7 .Adicionar 50 µl de solução de mistura de solução de anticorpos e conjugada enzima em cada poço, Misturar agitando suavemente a placa manualmente e incubar durante 30min a 25ºC com tampa.
9.2.8 Lavar: Remova a tampa com cuidado e despeje o líquido de poços e enxagúe o micropoços com 250 µl de solução diluída de solução de lavagem ( 4) no intervalo de 10s para 3 ou 4 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente.
9.2.9 Coloração: adicionar 50 µl de solução A e 50µl de solução B para cada bem. Misturar agitando suavemente a placa manualmente e incubar durante 15 min a 25ºC com tampa (ver 12.8).
9.2.10 Medir: adicionar 50 µl da solução de paragem para cada bem. Misturar agitando suavemente a placa manualmente e medir a absorvância a 450 nm (recomenda com a medida de comprimento de onda duplo de 450/630nm. Leia o resultado dentro de 5 min após a adição de solução de paragem).
10. Resultados
10.1 absorvância percentuais
Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorção do primeiro standard (norma zero) e multiplicado por 100%. O padrão de zero fica assim igual a 100% e os valores de absorvância estão apresentadas em porcentagens.
B --absorvância (padrão ou amostra)
B0 --absorvância padrão zero
10.2 curva padrão
----Para desenhar uma curva padrão: ter valor de absorção das normas como eixo y, semi concentração logarítmica da solução de padrões de lincomicina (ppb) como eixo x.
----A lincomicina concentração de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração é multiplicado pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguido, e a concentração real da amostra.
Por favor note:
Software Especial foi desenvolvido para a redução de todos os dados que podem ser fornecidas a pedido.
Factor de diluição:
Mel:
Método A......…..10
O método B......…..2
11. Sensibilidade, exactidão e precisão
A sensibilidade do teste: 0.1PPB
Limite de detecção:
Mel:
Método A........................…1.0PPB
O método B........................…0.2PPB
Precisão:
Mel .........................…85±15%