Kit de imunoensaio enzimático competitivo para
Análise quantitativa da estreptomicina
1. Antecedentes
A estreptomicina é um antibiótico aminoglicosídeo, amplamente aplicado no tratamento de doenças animais. Por ter neurotoxicidade e toxicidade renal, o seu resíduo em alimentos derivados de animais é prejudicial para o ser humano; é estritamente controlado em utilização na UE, nos EUA e na China. Atualmente, o ELISA é a abordagem comum na supervisão e controle da droga estreptomicina
Este kit é um novo produto para a detecção de resíduos de drogas com base na tecnologia ELISA, que custa apenas 45 minutos em cada operação e pode minimizar consideravelmente os erros de operação e a intensidade de trabalho.
2. Princípio do ensaio
Este kit baseia-se no ELISA competitivo directamente. Os poços de microtítulo estão revestidos com anticorpo de acoplamento. O resíduo de estreptomicina na amostra compete com o marcador enzimático revestido na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição do conjugado enzimático , o substrato cromogénico é utilizado para mostrar a cor. A absorvância da amostra está negativamente relacionada com o resíduo de estreptomicina no mesmo, após comparação com a curva padrão, multiplicada pelo factor de diluição, pode ser calculada a quantidade de resíduos de estreptomicina na amostra.
3. Aplicações
Este kit pode ser utilizado na análise quantitativa e qualitativa do resíduo de estreptomicina nos tecidos (carne de porco, frango, fígado), peixe e camarão, leite (leite cru, Leite UHT, leite reconstituído, leite pasteurizado, bebida láctea), soro, leite em pó (leite em pó inteiro, leite em pó desnatado), mel, geleia real, etc.
4. Reacções cruzadas
Estreptomicina .......................... 100.0%
Diidroestreptomicina ............... ….... … 106%
Sulfato de estreptomicina .................... 67%
Neomicina ......... … .................... … < 1%
Gentamicina ..................... … ..... … < 1%
Canamicina ........................... … < 1%
Amicacina .................... … ............ < 1%
Espectinomicina ......................... < 1%
Apramicina ............................... < 1%
5. Materiais necessários
5.1 equipamentos
---- espectrofotómetro de placa de microtitulação (450 nm/630 nm)
---- homogeneizador
---- misturador Vortex
---- centrífuga
---- balança analítica (indutância: 0,01g)
-----pipeta graduada: 10 ml
---- bolbo de borracha para pipetas
---- tubo de centrífuga de poliestireno: 2ml, 50ml
---- micropipetas: 20μl-200μl, 100μl-1000μl
250μl - multipipeta
5.2 reagentes
----ácido tricloroacético (ar)
----hidróxido de sódio (ar)
---- água desionizada
6. Componentes do kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidos com antigénio
Soluções padrão (6 frascos × 1 ml/frasco)
0ppb, 0,05ppb, 0,15ppb, 0,45ppb, 1,35ppb, 4,05ppb
Solução-padrão de pinagem: (1 ml/frasco) 1 ppm
Conjugado enzimático concentrado de 1 ml... tampa vermelha …
Diluente conjugado enzimático de 10 ml...... tampa verde
Solução de substrato A 7 ml .......... … tampa branca
Solução de substrato B 7 ml............tampa vermelha
Solução de travagem 7 ml................ … tampa amarela
solução de lavagem concentrada a 20 × , 40 ml
......................... tampa transparente
2 × solução de extracção concentrada 50 ml
............................ … tampa azul
7. Preparação dos reagentes
Solução 1: Ácido tricloroacético a 1 %
Dissolver 1,0g de ácido tricloroacético com 100 ml de água desionizada e misturar completamente.
Solução 2: Ácido tricloroacético a 1.5 %
Dissolver 1,5 g de ácido tricloroacético com 100 ml de água desionizada, misturar completamente.
Solução 3: 0,1mol/L de NaOH
Dissolver 0,4 g de hidróxido de sódio com 100 ml de água desionizada e homogeneizar.
Solução 4: Solução de extracção
Diluir a solução de extracção concentrada de 2 × com água desionizada na relação de volume de 1:1, que será utilizada para a extracção da amostra; esta solução pode ser conservada a 4ºC C durante 1 mês.
Solução 5: Solução de lavagem
Diluir a solução de lavagem concentrada a 20 × com água desionizada na proporção de volume de 1:19, que será utilizada para lavar as placas. Esta solução pode ser armazenada a 4ºC C por 1 mês.
8. Preparações para amostras
8.1 Aviso e precauções antes da operação
(A) Utilize pontas one-off no processo de experiência e altere as pontas quando absorver diferentes reagentes.
B) certificar-se de que todos os instrumentos experimentais estão limpos; caso contrário, o resultado do ensaio será afectado.
C) a amostra preparada deve ser utilizada imediatamente, não devendo conservar mais de 4 horas à temperatura ambiente.
8.2 tecido (porco, frango, fígado)
---- pesar 1.0 ± 0,05 g de amostra de tecido homogeneizado num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e, em seguida, adicionar 2 ml de ácido tricloroacético a 1% (solução 1), vórtice durante 5 minutos para misturar completamente.
--- centrífuga para separação: 3000 g/5 min/temperatura ambiente.
--- tomar 100 ml de sobrenadante, adicionar 30 ml de NaOH 0,1mol/L (solução 3) e, em seguida, adicionar 870ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição ................... 30
8.3 Produtos aquáticos
(1) camarão
---- pesar 1.0 ± 0,05 g de amostra homogeneizada de camarão num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e, em seguida, adicionar 2 ml de ácido tricloroacético a 1 % (solução 1), vórtice durante 5 min para misturar completamente.
--- centrífuga para separação: 3000 g/5 min/temperatura ambiente.
--- tomar 100 ml de sobrenadante, adicionar 30 ml de NaOH 0,1mol/L (solução 3) e, em seguida, adicionar 870ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
(2) peixe
---- pesar 1.0 ± 0,05 g de amostra de peixe homogeneizado num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e, em seguida, adicionar 2 ml de ácido tricloroacético a 1 % (solução 1), vórtice durante 5 min para misturar completamente.
--- centrífuga para separação: 3000 g/5 min/temperatura ambiente.
--- colher 100 ml de sobrenadante, adicionar 900 ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30 s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição ................... 30
8.4 leite (leite cru, leite UHT, leite reconstituído, leite pasteurizado, bebida láctea), soro
---- juntar 30 ml de leite ou de amostra de soro num tubo de centrifugação de poliestireno de 2 ml,
---- Adicionar 870ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição ................... 30
8.5 leite em pó
---- pesar 1.0 ± 0,05 g de amostra de leite em pó num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e, em seguida, adicionar 10 ml de água desionizada. Vórtice durante 5 min para misturar completamente.
--- colher 100 ml de sobrenadante, adicionar 900 ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30 s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição ................... 100
8.6Honey
---- pesar 1.0 ± 0,05 g de amostra de mel num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e, em seguida, adicionar 4 ml de água desionizada, vórtice durante 5 min até a amostra ser completamente dissolvida.
--- tomar 200ml de solução limpa, adicionar 600ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 30s para misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição ................... 20
8.5 geléia real
---- pesar 1.0 ± 0,05 g da amostra de geléia real num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml.
---- juntar 3 ml de ácido tricloroacético a 1.5 % (solução 2), vórtice durante 5 min e centrifugar à temperatura ambiente (20-25ºC C) durante 5 min, a 3000 g;
---- tomar 100 ml da camada sobrenadante (evitar o objecto flutuante) e misturar com 110 ml de NaOH 0,1mol/L (solução 3), ajustar o pH para 6-8 e, em seguida, adicionar 790 ml de solução de extracção (solução 4), vórtice durante 1 min , misturar completamente.
---- tomar 50 ml da solução preparada para ensaio.
Nota: Este método pode ter um efeito de fundo de 2 ppb, o que não afectará a determinação da amostra de acordo com os LMR.
Factor de diluição ................... 30
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes do ensaio
9.1.1 Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estão todos à temperatura ambiente (20 25ºC).
9.1.2 devolver todos os reagentes restantes a 2-8ºC imediatamente após a utilização.
9.1.3 Lavar os micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o fator vital para a reprodutibilidade da análise ELISA.
9.1.4 evitar a luz e cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 passos do ensaio
9.2.1 retirar todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25ºC C) durante mais de 30 min, agitar suavemente antes de utilizar.
9.2.2 retire os micropoços necessários e volte o resto para o saco com fecho de correr a 2-8ºC imediatamente.
9.2.3. Antes da utilização, a solução concentrada de lavagem e a solução concentrada de extracção devem ser galardoadas;
9.2.4 número: Numere cada posição do micropoço e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicata. Registe as posições das normas e das amostras.
9.2.5 Adicionar solução/amostra padrão: Adicionar 50µL de solução padrão ou de amostra preparada aos poços correspondentes.
9.2.6 diluir o conjugado enzimático concentrado: Misturar o conjugado enzimático concentrado e o diluente conjugado enzimático na relação de volume de 1:10 (por exemplo, 0,5ml de conjugado enzimático concentrado e 5ml de diluente conjugado enzimático), misturar completamente (esta mistura não pode ser conservada, utilizar imediatamente).
9.2.7 Adicionar o conjugado enzimático diluído (9.2.6): Adicionar 50µL do conjugado enzimático diluído a cada poço, agitar manualmente a placa para misturar e incubar durante 30 min a 25ºC C com tampa.
9.2.8 Lavar: Retirar a tampa suavemente e deitar o líquido dos poços e lavar os micropoços com 250µl solução de lavagem diluída (solução 5) a um intervalo de 10 s durante 4-5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente (a bolha de ar restante pode ser eliminada com a ponta não utilizada).
9.2.9 coloração: Adicionar 50µL da solução A e 50µL da solução B a cada poço. Misturar cuidadosamente agitando a placa manualmente e incubar durante 15 min a 25ºC C com a tampa (ver 12.8)
9.2.10 medida: Adicionar 50µL da solução de parada a cada poço. Misture suavemente agitando a placa manualmente e meça a absorvância a 450 nm (recomenda-se a medição com o comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado no espaço de 5 minutos após a adição da solução de parada.)
10. Resultados
Absorvância de 10.1 %
Os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorvância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100 %. O padrão zero é assim tornado igual a 100 % e os valores de absorvância são indicados em percentagens.
B - absorvância do padrão (ou da amostra)
B0 --absorvância de padrão zero
10.2 curva padrão
---- para traçar uma curva-padrão: Tomar como eixo x o valor de absorvância dos padrões, semilogarítmico da concentração da solução de padrões de estreptomicina (ppb).
---- a concentração de estreptomicina de cada amostra (ppb), que pode ser lida a partir da curva de calibração, é multiplicada pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguida, sendo obtida a concentração real da amostra.
Atenção:
Foi desenvolvido um software especial para todas as análises de dados , que pode ser fornecido mediante pedido.
11. Sensibilidade, precisão e precisão
Sensibilidade de teste: 0,05ppb
Limite de detecção
Tecido .................... …. ….... … 1.5ppb
Peixe e camarão ............... …. ….... … 1.5ppb
Leite, soro ........................... … 1,5 ppb
Leite em pó ................... … ....... 5 ppb mel ..................... …. … ....... 1 ppb
Geléia real ......................... … 1,5 ppb
Precisão
Tecido/peixe e camarão/soro/mel/geleia real ......................................................... 90 ± 15%
Leite/leite em pó ........................................ … 100 ± 30%
Precisão
O coeficiente de variação do kit ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e as amostras não tiverem sido regulados para a temperatura ambiente (20 25ºC).
12.2 não permita que os micropoços sequem entre passos para evitar uma reprodutibilidade sem sucesso e opere o passo seguinte imediatamente após ter passado o suporte dos micropoços.
12.3. Agitar cuidadosamente cada reagente antes de o utilizar.
12.4. Mantenha sua pele longe da solução de parada, pois é a solução H2SO4 de 0,5 M.
12.5 não utilize os kits desactualizados. Não troque os reagentes de lotes diferentes, pois irá diminuir a sensibilidade.
12.6 mantenha os kits ELISA a 2-8ºC, não congele. As placas de micropoços Seal Rest evitam a exposição solar directa da amostra padrão e o reagente cromogénico incolor é sensível à luz.
12.7 a solução de substrato deve ser abandonada se virar as cores. Os reagentes podem apresentar um mau sinal se o valor de absorvância (450/630nm) do padrão zero for inferior a 0.5 (A450nm < 0.5).
12.8 a reação de coloração necessita de 15 minutos após a adição da solução A e da solução B. e pode prolongar o tempo de incubação para 20 minutos se a cor for demasiado clara para determinar. Nunca exceda 25 min., pelo contrário, reduza o tempo de incubação correctamente.
12.9 a temperatura de reacção ideal é de 25ºC C. Uma temperatura mais elevada ou mais baixa irá provocar alterações nos valores de sensibilidade e absorvância.
13. Armazenagem
Condição de armazenamento: 2-8ºC.
Período de armazenamento: 12 meses.