Kit de imunoensaio enzimático competitivo para
Análise quantitativa da Tiamulina
1. Antecedentes
A Tiamulina é uma droga antibiótica pleuroputilin que é utilizada em medicina veterinária, especialmente para suínos e aves. Tem sido estabelecido um LMR rigoroso devido ao potencial efeito colateral no ser humano.
A HPLC ou LC-MS é a abordagem comum para detectar a tiamulina e é limitada pelas elevadas despesas e custos no pré-tratamento da amostra. O ELISA é rápido e preciso, podendo ser utilizado para a detecção de resíduos de tiamulina em amostras musculares.
2. Princípio do ensaio
Este kit baseia-se na tecnologia ELISA indirecta. Os poços de microtitulação são revestidos com antigénio de acoplamento. O resíduo de Tiamulina na amostra compete com o antigénio revestido na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição de anti-anticorpo marcado com enzima, o substrato TMB é utilizado para mostrar a cor. A absorvância da amostra está negativamente relacionada com a tiamulina reside nela, após comparação com a curva padrão, multiplicada pelo factor de diluição, pode ser calculada a quantidade de resíduos de tiamulina na amostra.
3. Aplicações
Este kit destina-se à análise quantitativa de resíduos de tiamulina em tecidos animais (carne de porco e de frango, etc.).
4. Reacções cruzadas
Tiamulina ........................... … 100%
Lincomicina … ..................... … ..... < 0.1%
Espectinomicina ................... … ..... < 0.1%
Apramicina .................... … ..... < 0.1%
5. Materiais necessários
5.1 Equipamento
---- espectrofotómetro de placa de microtitulação (450 nm/630 nm)
---- evaporador rotativo / aparelho de secagem de nitrogênio
---- homogeneizador
---- Shaker
---- misturador Vortex
---- centrífuga
---- balança analítica (indutância: 0,01g)
-----pipeta graduada: 10 ml
---- bolbo de borracha para pipetas
---- balão volumétrico: 100 ml, 500 ml, 1 L.
---- tubo de ensaio de vidro: 10ml
---- tubo de centrífuga de poliestireno: 2 ml, 10 ml, 50 ml
---- tubo de centrífuga de vidro: 10 ml
---- micropipetas: 20μl-200μl, 200μl-1000μl
250 ul - multipipeta
5.2 reagentes
---- acetato de etilo (ar)
----dimetilformamida (DMF, ar)
---- água desionizada
6. Componentes do kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidos com antigénio
Concentrado de soluções padrão (6 frascos × 1 ml/frasco)
0ppb, 3ppb, 9ppb, 27ppb, 81ppb, 243ppb
Solução padrão de pontas: 1 ppm (1 ml/frasco)
Conjugado enzimático de 7 ml... …......... …. Tampa vermelha
Solução de anticorpo de 7 ml......... ….. … tampa verde
Solução de substrato A 7 ml...........tampa branca
Solução de substrato B 7 ml .......... … tampa vermelha
Parar a solução 7 ml............…... tampa amarela
solução de lavagem concentrada a 20 × , 40 ml
......................... tampa transparente
2 × solução de extracção 50 ml ........ ….. … tampa azul
7. Preparação dos reagentes
Solução 1: Solução de extracção
Diluir 2 × de solução de extracção concentrada com água desionizada na relação de volume de 1:1, que será utilizada para a extracção da amostra. Esta solução pode ser armazenada por 1 mês em 4ºC.
Solução 2: Diluente de amostra
Misturar a solução de extracção com DMF na relação de volume de 22:3. Misture completamente para utilização.
Solução 3: Solução padrão
Diluir o concentrado da solução-padrão com a solução de extracção (solução 1) na relação de volume de solução-padrão de 1:9 (solução-padrão de 50 UL, solução de extracção de 450 UL). Esta solução-padrão diluída pode ser conservada durante 2 h a 20 25ºC.
Solução 4: Solução de lavagem
Diluir a solução de lavagem concentrada 20 x com água desionizada na proporção de volume de 1:19, que será utilizada para lavar a placa. A solução de lavagem diluída pode ser conservada durante um mês a 4ºC C.
8. Preparações para amostras
8.1 Aviso e precauções antes da operação
(A) Utilize pontas one-off no processo de experiência e altere as pontas quando absorver diferentes reagentes.
B) certificar-se de que todas as ferramentas experimentais estão limpas.
8.1 tecidos animais (carne de porco, frango, etc.)
---- pesar 2.0 ± 0,05 g de amostra de tecido homogeneizado num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e adicionar 8 ml de acetato de etilo, agitar ferozmente durante 10 min e, em seguida, centrifugar durante 5 min, a 20 25ºC, a 3000 g.
---- Transferir 1 ml do líquido sobrenadante transparente para um tubo de vidro limpo de 10 ml, secar com um fluxo de azoto a 50 60ºC.
---- dissolver o resíduo seco com 1 ml de diluente de amostra (solução 2), vórtice durante 1 min (a amostra pode ser turva, não influenciando o resultado).
----- tomar 50μl da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição .................... 4
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes do ensaio
9.1.1 Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estão todos à temperatura ambiente (20 25ºC).
9.1.2 devolver todos os reagentes restantes a 2-8ºC imediatamente após a utilização.
9.1.3 Lavar os micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o fator vital para a reprodutibilidade da análise ELISA.
9.1.4 evitar a luz e cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 passos do ensaio
9.2.1 retirar todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25ºC C) durante mais de 30 min, agitar suavemente antes de utilizar.
9.2.2 retire os micropoços necessários e volte o resto para o saco com fecho de correr a 2-8ºC imediatamente.
9.2.3 número: Numere cada posição do micropoço e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicata. Registe as posições das normas e das amostras.
9.2.4 Adicionar solução padrão/ amostra /conjugado enzimático/anticorpo: Adicionar 50µL de solução padrão (solução 3) / amostra aos poços correspondentes, adicionar 50µL de conjugado enzimático (componente kit), 50µL de anticorpo (componente kit), agitar suavemente para misturar completamente. E, em seguida, incubar a 37ºC C durante 30 min com a tampa.
9.2.5 Lavar: Retirar a tampa suavemente e deitar o líquido dos poços e lavar os micropoços com 250µl de solução de lavagem diluída (solução 4) a intervalos de 10 s durante 4-5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente.
9.2.6 coloração: Adicionar 50µL da solução A (componente do kit) e 50µL da solução B (componente do kit) a cada poço. Misturar cuidadosamente agitando a placa manualmente e incubar durante 15 minutos a 37ºC C com a tampa (ver 12.8).
9.2.9 medida: Adicionar 50µL da solução de paragem (componente do kit) a cada poço. Misture suavemente agitando a placa manualmente e meça a absorvância a 450 nm (recomenda-se a medição com comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado no espaço de 5 minutos após adicionar a solução de paragem)
10. Resultados
Absorvância de 10.1 %
Os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorvância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100 %. O padrão zero é assim tornado igual a 100 % e os valores de absorvância são indicados em percentagens.
Não
Padrão de absorvância B (ou amostra)
B0 -- padrão zero de absorvância
10.2 curva padrão
Para traçar uma curva-padrão: Tomar como eixo x o valor de absorvância dos padrões, semilogarítmico, da concentração da solução-padrão de tiamulina (ppb).
A concentração de tiamulina de cada amostra (ppb), que pode ser lida a partir da curva de calibração, é multiplicada pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguida e obtém-se a concentração real da amostra.
Aviso:
Foi desenvolvido um software especial para toda a interpretação de dados , que pode ser fornecido a pedido.
11. Sensibilidade, precisão e precisão
Sensibilidade de teste: 0,3 ppb
Limite de detecção:
Tecido ......... …... … ....................................... 2 ppb
Precisão:
Tecido .................................... … 80 ± 15%
Precisão:
O coeficiente de variação do kit ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e as amostras não tiverem sido regulados para a temperatura ambiente (20 25ºC).
12.2 não deixe que os micropoços sequem entre os passos para evitar a repetição sem sucesso e opere o passo seguinte imediatamente após ter passado o suporte dos micropoços.
12.3 agitar cada reagente cuidadosamente antes de o utilizar.
12.4 mantenha a sua pele afastada da solução de paragem, pois é a solução H2SO4 de 0,5 M.
12.5 não utilize os kits desactualizados. Não troque os reagentes de lotes diferentes, pois irá diminuir a sensibilidade.
12.6 mantenha os kits ELISA a 2-8ºC, não congele. Vedar as placas de micropoços de apoio evita a exposição solar direta durante todas as incubações. Recomenda-se a cobertura das placas de microtitulação para a amostra padrão e o reagente cromogénico incolor é sensível à luz.
12.7 a solução de substrato deve ser abandonada se virar as cores. Os reagentes podem apresentar um mau sinal se o valor de absorvância (450/630 nm) do padrão zero for inferior a 0.5 (A450nm < 0.5).
A reação de coloração necessita de 15 minutos após a adição da solução A e da solução B. e pode prolongar os intervalos de tempo de incubação para 20 minutos ou mais se a cor for demasiado clara para determinar. 12.8 Nunca exceda 25 min., pelo contrário, reduza o tempo de incubação correctamente.
12.9 a temperatura de reacção ideal é de 37ºC C. Uma temperatura mais elevada ou mais baixa irá provocar alterações nos valores de sensibilidade e absorvância.
13. Armazenagem
Condição de armazenamento: 2-8ºC.
Período de armazenamento: 12 meses