2 miscela master PCR Plus Mix con kit tampone di caricamento

Descrizione
Plus 2X Mix è una soluzione premiscelata e pronta all'uso contenente Plus DNA polimerasi, dNTP, MgCl2  e tampone di reazione a concentrazioni ottimali per un'efficace amplificazione di stampi di DNA mediante PCR. Per preparare la PCR finale, vengono aggiunti solo i primer e il DNA stampo. La miscela Plus contribuisce a una PCR altamente riproducibile riducendo il rischio di errori di pipettaggio, errori di calcolo e contaminazione. Contribuisce inoltre ad aumentare la sensibilità aggiungendo un potenziatore.

Taq Plus, una miscela di taq e pfu polimerasi, mescola la processività di taq con l'alta fedeltà di pfu. Pertanto, questo Taq Plus appositamente formulato consente l'amplificazione della fedeltà dell'higer e dei templati più lunghi rispetto alle formulazioni a singolo enzima. È inoltre una scelta migliore per amplificare modelli complessi, come ad esempio modelli ricchi di GC. Ed è adatto come sostituzione diretta per la Taq polimerasi ordinaria nella maggior parte delle applicazioni. Inoltre, l'uso di Taq Plus dà come risultato 3´-da prodotti PCR sovrastanti, che possono essere utilizzati nel clone TA.

Caratteristiche
Conveniente : Quando si prepara la PCR finale, vengono aggiunti solo primer e DNA stampo
Elevata efficienza : Risparmio di tempo semplificando il processo  
Riproducibile : Riduzione del rischio di errori di pipettaggio, errori di calcolo e contaminazione

Applicazioni
PCR lunga con alta fedeltà
PCR altamente riproducibile per stampi complessi
PCR ad alta resa per modelli complessi
Generazione di prodotti PCR per clonazione TA

Definizione unità
Una unità è definita come la quantità dell'enzima necessaria per catalizzare l'incorporazione di 10 Nm di dNTP in una forma insolubile in acido in 30 minuti a 70°C usando DNA di sperma di ering come substrato.

2×di miscela PCR Plus
20 mm Tris-HCl (pH 8.0), 100 mm KCl, 3 mm MgCl2 , 400 mm dNTP, 0.1 U/μl Plus DNA polimerasi, blu bromofenolo, altro intensificatore e stabilizzante
Conservare a -20°C.

Protocollo PCR di base
1. Aggiungere i seguenti componenti in una provetta sterile per microcentrifuga da 50 μl, appoggiata su ghiaccio:

2. Miscelare il contenuto della provetta e sovrapporre con 50 μl di olio minerale o siliconico.
3. Chiudere le provette e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto fino al fondo.
Incubare le provette in un termociclatore a 94°C per 3 minuti per denaturare completamente la dima.
5. Eseguire 25-35 cicli di amplificazione PCR come segue:

Incubare per altri 10 minuti a 72°C e mantenere la reazione a 4°C. I campioni possono essere conservati a -20°C fino all'uso.

Analizzare i prodotti di amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio e visualizzarli mediante colorazione con bromuro di etidio. Utilizzare gli standard appropriati per il peso molecolare.

Note sulle condizioni del ciclo

   La denaturazione iniziale può essere eseguita per un intervallo di 1-5 minuti a 95°C a seconda del contenuto di GC del template.

  La temperatura ottimale di ricottura è di 5°C inferiore alla temperatura di fusione del DNA duplex a temperatura di innesco. Se si ottengono prodotti PCR non specifici, l'ottimizzazione della temperatura di ricottura può essere eseguita aumentando la temperatura gradualmente di 1-2°C.

   Il numero di cicli di PCR dipende dalla quantità di DNA stampo nella miscela di reazione e dalla resa attesa del prodotto di PCR. 25-35 cicli sono solitamente sufficienti per la reazione PCR di maggioranza. Basse quantità di modello iniziale possono richiedere 40 cicli.

   Il tempo della fase finale di estensione può essere esteso per ampliconi che saranno clonati in vettori T/A.