Kit de imunoensaio enzimático competitiva para
Análise quantitativa de espectinomicina
1. Justificativa
A espectinomicina é um antibiótico aminocyclitol, que é um novo antibiótico especial para o tratamento da gonorréia. Pode parar a síntese de proteínas de cytoderm de bactérias e impedir a liberação da proteína sintetizada, de modo que tem fortes bacteriostasis.
Este kit é um novo produto baseado na tecnologia de ELISA, que é rápido e fácil, precisas e minúsculas em comparação com a política comum de análise instrumental e só precisa de 45min em um prazo para que possa ser consideravelmente minimizar o erro de funcionamento e intensidade de trabalho.
2. Princípio de teste
Este kit é baseada na tecnologia de ELISA competitivo de indirecta. Os poços de microtitulação são revestidos com antígeno de acoplamento. A espectinomicina resíduo em amostra concorre com o antígeno revestidos na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição de substrato, TMB conjugada enzima é usado para mostrar a cor. Absorvência da amostra é negativamente relacionado à espectinomicina resíduo em ti, depois de comparar com a curva padrão, multiplicado pelo factor de diluição, espectinomicina quantidade de resíduos na amostra pode ser calculado.
3. Os pedidos
Este kit pode ser usado na análise quantitativa e qualitativa de espectinomicina resíduo no tecido(frango, fígado de frango, porco, suína fígado de peixe, camarão)...
4. Reações cruzadas
A espectinomicina.....................…100%
Neomicina........................…<0,1%
A estreptomicina.......................…<0,1%
Gentamicina........................<0,1%
Apramicina..........................<0,1%
5. Materiais Necessários
5.1 Equipamentos:
----Placa de microtitulação espectrofotómetro (450nm/630nm)
----Evaporador rotativo ou instrumentos de secagem de azoto
----Homogeneizador
----Shaker
----Vórtex
----Centrifugar
----Balança analítica (A indutância: 0,01g)
----Uma pipeta graduada: 10ml
----Lâmpada de pipetas de Borracha
----Balão volumétrico: 1 L
----Tubos de centrífuga de Poliestireno Expandido: 2ml, 50ml
----Proveta de vidro:10ml
----Micropipetas: 20ul-200UL 100-10000UL UL,
50ul-300ml multipipette
5.2 Reagentes
----Ácido tricloroacético (AR)
----Cloreto de sódio (NaCl, AR)
----Cloreto de potássio (KCl, AR)
----De fosfato monopotássico (KH2PO4, AR)
----Hidrogenofosfato dissódico dodeca-hidratado
(Na2HPO4.12H2O AR)
----Água desionizada
6. Componentes do Kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidas com antigen
Soluções padrão(6 garrafas,1ml/garrafa)
0ppb, 0.2Ppb, 0.6Ppb, 1.8Ppb, 5.4Ppb, 16.2ppb
Solução padrão aditiva:(1ml/garrafa) 1 ppm
A vacina conjugada enzima 7ml.........….… tampa vermelha
Solução de anticorpos 7ml...… .....….… tampa verde
Solução a 7 ml ............… .....…tampa branca
Solução B 7ml .............….….… tampa vermelha
Solução de paragem 7ml...............…tampa amarela
20×concentrado 40ml de solução de lavagem
.....................… Tampa transparente
2×concentrado 50ml de solução de extracção
.....................… Tampa transparente
7. Preparação de reagentes
Solução 1: 1% ácido tricloroacético-0.01M PBS
Pesar 10,0 g de ácido tricloroacético , 4.0G de NaCl 0,1 g de KCl, 0,1 g de KH2PO4 e 2.68g de Na2HPO4'12H2O, dissolver em água desionizada e diluir a 1000 ml.
Solução 2: solução de extracção:
Diluir a 2×concentrados de solução de extracção com água deionizada em relação ao volume de 1:1(ex. 10ml de 2×concentrados de solução de extracção + 10ml de água deionizada), que será utilizada para dissolver a amostra extraída. A solução de extracção diluídos pode ser conservado durante 1 mês a 4ºC.
Solução 3: solução de lavagem:
Diluir a 20×concentrado solução de lavagem com água deionizada em relação ao volume de 1:19(ex. 5 ml de solução de lavagem concentrada 2×+ 95ml de água deionizada), que será utilizada para dissolver a amostra extraída. A solução de extracção diluídos pode ser conservado durante 1 mês a 4ºC.
8. Preparação da amostra
8.1 Aviso e precauções antes da operação:
(A) Use as dicas pontuais no processo de experimento e alterar as dicas para absorver o reagente diferente.
(B) Se certificar de que todos os instrumentos experimentais estão limpos.
(C) Manter sem tratamento de amostras de tecido em congelar.
(D)Ser cuidadosamente quando tirar o supernate após centrifugação, inclinadas o tubo é recomendado.
(E) as amostras tratadas podem ser conservados para as 12h.
8.2 Tecido Mole
----Homogeneizar as amostras;
----Tomar 2,0±0,05g da amostra homogeneizada num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e adicionar 10 ml de solução de ácido tricloroacético a 1%-0.01M PBS (solução 1), agitar durante 5 minutos com o agitador;
----Centrífuga para separação: 3000g / 5min / temperatura ambiente;
----Transferência do supernate 200ml para um tubo de centrifugação de poliestireno de 2 ml e adicionar em seguida 200 ml de solução de extracção (solução 2), misturar completamente(o pH é de 5 a 7);
----Tomar 50 ml da solução preparada para o ensaio.
Factor de diluição: 10
8.3 Leite
--------Tomar 50 ml de amostra de leite directamente para o ensaio.
Factor de diluição: 1
9. Processo de ensaio
9.1 Aviso antes de doseamento
9.1.1 Verifique se todos os reagentes e micropoços são todos em temperatura ambiente (20-25ºC).
9.1.2 Devolver todos os reagentes de repouso para 2-8ºC imediatamente após a utilização.
9.1.3 Lavar o micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o factor vital para a reprodutibilidade da análise de ELISA.
9.1.4 Evitar a luz e a cobrir os micropoços durante a incubação.
9.2 As etapas de ensaio
9.2.1 Tomar todos os reagentes para fora em temperatura ambiente (20-25ºC) por mais de 30min, agitar antes de usar.
9.2.2 Obter o micropoços necessários e devolva o resto no saco zip-lock em 2-8ºC imediatamente.
9.2.3 Número: numeradas todas as posições microwell e todas as normas e as amostras devem ser executados em duplicado. Registre as normas e as posições de amostras.
9.2.4 Adicionar solução padrão amostra / / / anticorpo conjugado enzimático: adicionar 50 µl da solução padrão.o componente do kit) ou amostra preparada para poços correspondente. Adicionar 50 μl da vacina conjugada enzima(componente do kit), e depois adicionar 50 µl da solução de anticorpos.o componente do kit). Misturar com precaução a placa oscilante manualmente e incubar durante 30min a 37ºC com tampa.
9.2.5 Lavar: Remova a tampa com cuidado e despeje o líquido de poços e enxagúe o micropoços com 250 µl de solução diluída de solução de lavagem (3) no intervalo de 10s por 4 a 5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente (resto bolhas de ar podem ser eliminados com a ponta não utilizados).
9.2.8 Coloração: adicionar 50 µl da solução de um componente do kit.) e 50µl de solução B.o componente do kit) para cada bem. Misturar com precaução a placa oscilante manualmente e incubar durante 15min a 37ºC com tampa.
9.2.9 Medir: adicionar 50 µl da solução de paragem em cada componente do kit de bem. Misturar com precaução a placa oscilante manualmente e medir a absorvância a 450 nm (recomenda com a medida de comprimento de onda duplo de 450 / 630nm. Leia o resultado dentro de 5 min após a adição da solução de paragem).
10. Resultados
10.1 absorvância percentuais
Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorção do primeiro standard (norma zero) e multiplicado por 100%. O padrão de zero fica assim igual a 100% e os valores de absorvância estão apresentadas em porcentagens.
B --absorvância (padrão ou amostra)
B0 --absorvância padrão zero
10.2 curva padrão
----Para desenhar uma curva padrão: ter valor de absorção das normas como eixo y, semi da concentração do logarítmica a espectinomicina solução padrões (ppb) como eixo x.
----A espectinomicina concentração de cada amostra (ppb), que pode ser lida na curva de calibração é multiplicado pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguido, e a concentração real da amostra.
Aviso: Foi desenvolvido um software especial para o cálculo do resultado, que pode ser fornecido a pedido.
11. Sensibilidade, exactidão e precisão
A sensibilidade do teste: 0.2PPB
Limite de detecção: Tissue :2 ppb de leite :0,2 ppb
Precisão:
Leite de tecido ............….........90±20%
Precisão:
Coeficiente de variação do kit de ELISA é inferior a 10%.
12. Aviso
12.1 Os valores médios da absorvância valores obtidos para os padrões e as amostras será reduzida se os reagentes e amostras não tenham sido regulada a temperatura ambiente (20-25ºC).
12.2 não permitem micropoços secar entre as etapas para evitar tentativas de reprodutibilidade e operar o próximo passo imediatamente após bater o micropoços titular.
12.3. Agitar suavemente cada reagente antes de usar.
12.4. Mantenha a sua pele longe da solução de paragem é 0,5M H2SO4 solução.
12.5 Não use os kits desatualizado. Não trocar os reagentes de lotes diferentes, ou então ela cairá a sensibilidade.
12.6 manter os kits ELISA em 2-8ºC,não congelar. Retentor assentam as placas microwell, evitar directamente do sol durante todo o incubações. Cobrindo as placas de microtitulação é recomendado.
Solução de substrato 12,7 deve ser abandonada se transforma de cores. Os reagentes podem ser vire ruim se o valor de absorvência (450 / 630nm) do padrão de zero for inferior a 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 A coloração das necessidades de reacção 15min após a adição da solução A e solução B. e você pode prolongar o tempo de incubação se a cor for demasiado clara a determinar. Nunca exceda 30min, pelo contrário, encurtar o tempo de incubação adequadamente.
12.9 A melhor temperatura de reação é de 37ºC. Maior ou menor temperatura provocará alterações de sensibilidade e os valores de absorvência.
13. Para bagagem
Condições de armazenamento: 2-8ºC.
Período de armazenamento de dados: 12 meses.